qPCR實(shí)驗(yàn)的Ct值有什么作用？

qPCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)的所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。簡(jiǎn)單講，Ct值就是qPCR中起始模板擴(kuò)增達(dá)到一定產(chǎn)物量時(shí)，所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。那么你知道qPCR實(shí)驗(yàn)中的Ct值有什么作用嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、指數(shù)擴(kuò)增、模板量與Ct值的關(guān)系

理想情況下，qPCR中的基因經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)數(shù)被指數(shù)擴(kuò)增而積累，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴(kuò)增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個(gè)數(shù)。然而qPCR反應(yīng)并不是一直處于理想情況下，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到“一定產(chǎn)物量"時(shí)，此時(shí)循環(huán)個(gè)數(shù)為Ct值，處于指數(shù)擴(kuò)增時(shí)期。Ct值與起始模板量的關(guān)系：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。

二、擴(kuò)增曲線、熒光閾值與一定產(chǎn)物量

qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物量是以熒光信號(hào)的形式直接呈現(xiàn)，也就是擴(kuò)增曲線。在PCR早期，擴(kuò)增處于理想情況下，循環(huán)數(shù)較少，產(chǎn)物積累少，產(chǎn)生熒光的水平不能與熒光本底背景明顯地區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生增加進(jìn)入指數(shù)期。可以在PCR反應(yīng)剛處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，以此作為“一定產(chǎn)物量"，并且由此來(lái)推斷模板最初的含量。因此，一定產(chǎn)物量對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，也就是熒光閾值。

在PCR的后期，擴(kuò)增曲線不再呈現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增，進(jìn)入線性期和平臺(tái)期。

三、Ct值的重現(xiàn)性

PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極hao，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

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