支原體污染的檢測(cè)方法有哪些？

支原體污染一般在顯微鏡下不可見，很難察覺，但細(xì)胞會(huì)受到極大的損傷，主要通過以下途徑影響細(xì)胞生長(zhǎng)及功能。那么支原體污染的檢測(cè)方法有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、分離培養(yǎng)法

檢測(cè)方法：將待檢樣品接種到適合支原體生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中，如有支原體污染，液體培養(yǎng)基顏色會(huì)改變，固體培養(yǎng)基將會(huì)有菌落生長(zhǎng)。

優(yōu)點(diǎn)：該方法被稱為支原體培養(yǎng)法的金標(biāo)準(zhǔn)，可以檢測(cè)絕大多數(shù)支原體。

缺點(diǎn)：支原體生長(zhǎng)到一定數(shù)量才能判斷是否有污染，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體的快速檢測(cè)

二、原位染色法

檢測(cè)方法：通過染色試劑（如DAPI、Hoechst 等）對(duì)待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察待測(cè)樣品的熒光判斷支原體污染。

優(yōu)點(diǎn)：可清晰直觀的看到支原體微粒。

缺點(diǎn)：死亡細(xì)胞釋放的DNA也會(huì)被染色，在支原體輕度污染時(shí)，較難判斷是否有支原體污染。

三、化學(xué)發(fā)光法

檢測(cè)方法：利用支原體te有酶的活性并通過ATP依賴的螢光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，通過比較檢測(cè)試劑加入前后ATP量的變化來確定樣品是否有支原體污染。

優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)快速，僅需15min即可完成檢測(cè)。

缺點(diǎn)：該方法只能檢測(cè)活的支原體，如果支原體死亡，將無法通過ATP的變化判斷支原體污染。

四、探針法qPCR

檢測(cè)方法：設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，通過探針法qPCR高靈敏檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞等生物材料中是否有支原體污染。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，檢測(cè)快速，可一次性檢測(cè)大量樣品，PCR擴(kuò)增后無需電泳分析即可判斷是否具有支原體污染。

缺點(diǎn)：該方法靈敏度很高，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較為苛刻，且需要精密的qPCR儀器。

五、等溫?cái)U(kuò)增變色法

檢測(cè)方法：通過設(shè)計(jì)4-6對(duì)特異性引物，在一定的恒定溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物進(jìn)行核酸的快速擴(kuò)增，并且通過顏色變化而無需電泳分析即可確定是否有支原體污染。

優(yōu)點(diǎn)：不需要反復(fù)的升溫和降溫，不需要精密的儀器，在恒定的溫度下即可對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，無需電泳分析，通過顏色變化即可判斷是否具有支原體污染。

缺點(diǎn)：對(duì)引物要求較高，需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物，且擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于測(cè)序。

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