貼壁細(xì)胞傳代的方法和注意事項(xiàng)

　　細(xì)胞培養(yǎng)幾乎是所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。其中，細(xì)胞傳代是將部分細(xì)胞分離出來(lái)，重新接種到新的培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞重新獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)條件和生長(zhǎng)空間的過程。對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%-90%時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)最好，此時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞傳代。下面讓我們一起來(lái)看看貼壁細(xì)胞傳代的方法和注意事項(xiàng)吧！
 

　　一、貼壁細(xì)胞傳代（以T25瓶為例）
 

　　1.顯微鏡下觀察細(xì)胞匯合度大于80%即可傳代；
 

　　2.將移液管、移液槍、T25培養(yǎng)瓶、1ml槍頭、PBS溶液等放入超凈工作臺(tái)，紫外燈滅菌30min后再通風(fēng)30min；
 

　　3.培養(yǎng)基放置37℃水浴鍋預(yù)熱；
 

　　4.將胰酶和培養(yǎng)基用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái)；
 

　　5.在培養(yǎng)箱內(nèi)旋緊培養(yǎng)瓶瓶蓋，拿出細(xì)胞，用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái)；
 

　　6.吸棄上清液；
 

　　7.用5mlPBS液潤(rùn)洗細(xì)胞，吸棄PBS；
 

　　8.培養(yǎng)瓶加入1ml胰酶，輕輕晃動(dòng)使胰酶充分覆蓋細(xì)胞層，放入培養(yǎng)箱中孵育；
 

　　9.在顯微鏡下觀察細(xì)胞解離狀況，細(xì)胞明顯變圓、細(xì)胞間隙增大，輕輕晃動(dòng)可呈現(xiàn)流沙狀即可終止；
 

　　10.加入4ml培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使其分散成單個(gè)細(xì)胞；
 

　　11.收集細(xì)胞懸液到50ml離心管中，1000-1200r/min離心，3-5min去除胰酶；
 

　　12.離心管用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái)，吸棄上清液，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；
 

　　13.將細(xì)胞懸液按推薦傳代比例分裝到培養(yǎng)瓶，補(bǔ)充適量培養(yǎng)基，搖晃使細(xì)胞分布均勻，并做好標(biāo)記；
 

　　14.在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度及狀態(tài)，把細(xì)胞放回培養(yǎng)箱，旋松瓶蓋以便進(jìn)行氣體交換。
 

　　二、注意事項(xiàng)：
 

　　1.PBS潤(rùn)洗細(xì)胞時(shí)，從與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)輕輕加入PBS，避免沖刷到細(xì)胞層；
 

　　2.不同細(xì)胞的胰酶所需消化時(shí)間不一樣，消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞貼壁特性而定，可每30s觀察一次。
 

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