IPSC培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程

更新時(shí)間：2026-02-09

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iPSC來(lái)源廣泛，具有較強(qiáng)的體外擴(kuò)增、復(fù)制和分化能力、較低的免疫原性、較高的基因編輯效率等?；谶@些優(yōu)勢(shì)，iPSC技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，是個(gè)性化細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)研究的重要科學(xué)工具。

那么它具體怎么培養(yǎng)呢？

一、IPSC培養(yǎng)之實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

試劑：預(yù)熱的無(wú)滋養(yǎng)層培養(yǎng)基（如mTeSR™ Plus， E8）、基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板、解離試劑（如 Gentle Cell Dissociation Reagent，不含酶）、PBS、ROCK抑制劑（Y-27632）。

設(shè)備：37°C， 5% CO?培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺(tái)。

二、IPSC培養(yǎng)之基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板

用預(yù)冷的PBS或無(wú)血清DMEM按說(shuō)明書比例稀釋基質(zhì)膠。

迅速將稀釋液加入培養(yǎng)板中（6孔板約1 mL/孔），室溫靜置至少1小時(shí)或4℃過(guò)夜。

使用前吸棄包被液，無(wú)需晾干，直接接種細(xì)胞。

三、IPSC培養(yǎng)之日常觀察與換液

每日觀察：在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。健康的iPSC克隆應(yīng)邊界清晰、細(xì)胞核大、核質(zhì)比高、克隆內(nèi)細(xì)胞排列緊密。邊緣出現(xiàn)扁平、拉長(zhǎng)或透明的細(xì)胞是分化的征兆。

換液：每天換液一次。輕柔吸棄舊培養(yǎng)基，沿孔壁緩慢加入預(yù)溫的新鮮培養(yǎng)基，避免吹打克隆。

四、IPSC培養(yǎng)之傳代（關(guān)鍵步驟）

iPSC通常每4-7天傳代一次，當(dāng)克隆大到開始互相接觸時(shí)進(jìn)行。

方案A：酶解法（EDTA或Accutase）：

1. 吸棄培養(yǎng)基，用PBS輕柔清洗一次。

2. 加入適量含0.5 mM EDTA的PBS或Accutase，37℃孵育3-5分鐘。

3. 在顯微鏡下觀察，當(dāng)克隆邊緣開始卷起、細(xì)胞間隙變大時(shí)，迅速吸棄解離液。

4. 加入含10 μM ROCK抑制劑的完全培養(yǎng)基，用1mL移液器輕柔吹打成小團(tuán)塊（約幾十到幾百個(gè)細(xì)胞一團(tuán)）。切忌吹成單細(xì)胞！

5. 離心，重懸，按適當(dāng)比例（通常1:6至1:20）接種到新包被的板上。

方案B：手動(dòng)挑克隆法：

用于去除分化部分、單克隆篩選或處理珍貴細(xì)胞系。

在顯微鏡下用拉細(xì)的巴斯德管或?qū)Ｓ锰翎?，物理刮取未分化的克隆區(qū)域，轉(zhuǎn)移至新孔。

關(guān)鍵點(diǎn)：傳代后24小時(shí)內(nèi)，在培養(yǎng)基中加入ROCK抑制劑，可顯著提高克隆形成率和存活率。

五、IPSC培養(yǎng)之凍存與復(fù)蘇

凍存：使用適合無(wú)血清培養(yǎng)的專用凍存液（如CryoStor® CS10），或含10% DMSO + 30%血清替代物 + 60%基礎(chǔ)培養(yǎng)基的自配凍存液。以小團(tuán)塊形式凍存。

復(fù)蘇：

1. 快速解凍細(xì)胞。

2. 用含大量ROCK抑制劑的培養(yǎng)基重懸并接種。

3. 24小時(shí)后全量換液為正常培養(yǎng)基。

六、常見問(wèn)題與對(duì)策

問(wèn)題	可能原因	解決方案
自發(fā)分化率高	傳代過(guò)度消化（單細(xì)胞過(guò)多）、接種密度過(guò)低、細(xì)胞過(guò)密、培養(yǎng)基過(guò)期或pH不穩(wěn)定。	優(yōu)化消化時(shí)間；提高接種密度；及時(shí)傳代；使用新鮮培養(yǎng)基，檢查培養(yǎng)箱CO?濃度。
克隆不生長(zhǎng)/死亡	傳代損傷（單細(xì)胞化嚴(yán)重）、復(fù)蘇損傷、ROCK抑制劑未加或失效、基質(zhì)膠包被失效。	傳代時(shí)保持細(xì)胞團(tuán)塊；確保使用ROCK抑制劑；驗(yàn)證基質(zhì)膠活性和包被流程。
細(xì)胞形態(tài)不佳（扁平、松散）	開始分化、培養(yǎng)體系不適用、污染（如支原體）。	鏡下標(biāo)記并刮除分化區(qū)域；檢查培養(yǎng)基和基質(zhì)膠匹配性；進(jìn)行支原體檢測(cè)。
克隆難以吹下	基質(zhì)膠批號(hào)差異、消化時(shí)間不足、細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。	適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間或在37℃孵育；嘗試不同批號(hào)基質(zhì)膠。

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