聚乙烯亞胺（PEI）轉染試劑在哺乳動物細胞基因遞送中的應用

聚乙烯亞胺（Polyethylenimine, PEI）作為一種陽離子聚合物轉染試劑，因其高效的基因遞送能力和較低的細胞毒性，已成為哺乳動物細胞瞬時轉染和病毒載體生產的工具之一。本文系統介紹了使用Polysciences公司PEI Max轉染試劑進行HEK293T細胞轉染的標準實驗流程，為基因功能研究和重組蛋白表達提供可靠的技術參考。

一、實驗原理

PEI是一種帶正電荷的高分子聚合物，其分子結構中富含氨基基團，在生理pH條件下可質子化形成正電荷密度。這種特性使PEI能夠通過靜電相互作用與帶負電荷的質粒DNA形成納米級復合物（polyplex），有效壓縮DNA并保護其免受核酸酶降解。PEI-DNA復合物通過內吞作用進入細胞，隨后PEI的"質子海綿效應"促進內涵體逃逸，使DNA釋放至細胞核內完成轉錄表達。

二、材料與試劑

主要試劑：

PEI Max®—Transfection Grade Linear Polyethyleneimine Hydrochloride（MW 40,000，Polysciences，貨號24765或23966）

HEK293T細胞（ATCC CRL-3216）

高純度質粒DNA（無內毒素，A260/A280比值1.8-2.0）

Opti-MEM減血清培養基（Gibco）

wanquanDMEM培養基（含10% FBS、1×GlutaMAX、青霉素-鏈霉素）

儀器設備：

生物安全柜、CO?培養箱（37°C，5% CO?）、臺式離心機、倒置熒光顯微鏡

三、實驗方法

3.1 細胞準備

轉染前24小時，將HEK293T細胞以3×10?個細胞/10 cm培養皿的密度接種于wanquanDMEM培養基中，確保轉染時細胞匯合度達到70-90%。細胞狀態直接影響轉染效率，應選用處于對數生長期、形態良好、無支原體污染的細胞。

3.2 PEI工作液配制

將PEI Max粉末溶解于Milli-Q水中，配制1 mg/mL儲存液，經0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝保存于-20°C，避免反復凍融。使用前解凍并充分混勻。

3.3 轉染復合物制備

采用DNA:PEI質量比1:3的優化方案：

在無菌EP管中，將10 μg質粒DNA稀釋于500 μL Opti-MEM中，輕柔混勻（Mix 1）

另取一管，將30 μL PEI工作液（1 mg/mL）稀釋于500 μL Opti-MEM中，室溫靜置5分鐘（Mix 2）

將Mix 2逐滴加入Mix 1中，輕輕渦旋混勻，室溫孵育15-20分鐘，形成DNA-PEI復合物

3.4 轉染操作

吸除培養皿中的舊培養基，用預溫PBS輕柔洗滌細胞一次

加入8 mL新鮮wanquanDMEM培養基（含血清和抗生素）

將轉染復合物逐滴均勻加入培養皿中，輕輕晃動使混合均勻

37°C、5% CO?條件下繼續培養6小時后，可選擇更換為wanquan培養基（對于敏感細胞系）

根據實驗目的，在轉染后24-72小時收集細胞進行后續分析

3.5 轉染效率評估

轉染后48小時，可通過以下方法評估轉染效率：

熒光顯微鏡觀察：如使用GFP報告基因，直接在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄

流式細胞術：胰酶消化細胞后，通過流式細胞儀定量分析GFP陽性細胞比例

Western Blot：檢測目的蛋白表達水平，以β-actin作為內參

四、關鍵參數優化

4.1 DNA:PEI比例優化

不同細胞系對PEI的耐受性存在差異。對于HEK293T細胞，1:3的DNA:PEI質量比通常可獲得zui-佳轉染效率（>80%）和細胞活性的平衡。對于敏感細胞系，可適當降低至1:2或1:2.5。

4.2 細胞密度控制

細胞匯合度過低（<60%）會導致轉染效率下降；匯合度過高（>95%）則因接觸抑制影響細胞狀態，建議維持在70-90%。

4.3 血清存在下的轉染

PEI轉染可在血清存在條件下進行，這簡化了操作流程并減少了細胞應激。但高濃度血清（>10%）可能輕微降低轉染效率，建議在轉染復合物形成階段使用無血清培養基。

五、慢病毒包裝應用

PEI轉染試劑廣泛應用于第三代慢病毒包裝系統：

將HEK293T細胞以1.8×10?/10 cm皿密度接種，培養18小時

轉染混合物配制（每皿）：

轉移質粒（含目的基因）：10 μg

包裝質粒psPAX2：5 μg

包膜質粒pMD2.G：3-5 μg

PEI（1 mg/mL）：30-50 μL

轉染后6-8小時更換培養基，48小時和72小時分別收集病毒上清

0.45 μm濾膜過濾，-80°C分裝保存或進行病毒濃縮

六、注意事項

質粒質量：必須使用高純度、無內毒素的質粒DNA，內毒素污染會顯著降低轉染效率并誘導細胞死亡

復合物形成時間：DNA-PEI孵育時間應控制在15-20分鐘，過長會導致復合物聚集沉淀

細胞傳代次數：建議使用低代次細胞（<30代），高代次細胞轉染效率可能下降

支原體檢測：定期檢測細胞支原體污染，污染細胞轉染效率顯著降低且結果不可靠

七、結論

Polysciences PEI Max轉染試劑憑借其高效、經濟、操作簡便的優勢，已成為實驗室基因遞送和病毒載體生產的標準化工具。通過優化轉染參數，研究人員可在HEK293T等常用細胞系中實現高效的基因表達和蛋白生產。

保障提示： 為確保實驗結果的可靠性和可重復性，建議通過正規渠道采購Polysciences轉染試劑。

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